一、目的

學習細菌的培養方法及培養基的配置。

二、原理

在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是*的實驗材料。質粒的保存、增殖和轉化；基因文庫的建立等都離不開細菌。特別是常用的大腸桿菌。

大腸桿菌是含有長約3000kb的環狀染色體的棒狀細胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機鹽的培養基上快速生長。當大腸桿菌在培養基中培養時，其開始裂殖前，入一個滯后期。然后進入對數生長期，以20~30min復制一代的速度增殖。zui后，當培養基中的營養成分和氧耗盡或當培養基中廢物的含量達到抑制細菌的快速生長的濃度時，菌體密度就達到一個比較恒定的值，這一時期叫做細菌生長的飽和期。此時菌體密度可達到1×109~2×109/mL。

培養基可以是固體的培養基，也可以是液體培養基。實驗室中zui常用的是LB培養基。

三、實驗材料、試劑與主要儀器

（一） 實驗材料

大腸桿菌

（二） 試劑

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化鈉

4、1mol/LNaOH

5、瓊脂粉

6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）

（三）儀器

1、培養皿

2、帶帽試管

3、涂布器

4、滅菌鍋

5、無菌操作臺（含酒精燈、接種環、滅菌牙簽等）

6、恒溫搖床

四、操作步驟

（一）LB培養基的配制

配制每升培養基，應在950m1去離子水中加入：

細菌培養用胰蛋白胨 10g

細菌培養用酵母提取物 5g

NaCl 10g

搖動容器直至溶質*溶解，用1mol/L NaOH調節pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養基。

LB固體培養基是在其液體培養基的基礎上另加瓊脂粉15g/L。

（二）細菌的培養

（１）在液體培養基中培養

1、過夜培養

⑴取5ml液體培養基加入一只無菌的試管中。

⑵用接種環或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養液中。

⑶蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37℃過夜培養。

２、大體積培養

⑴按1∶100的比例將過夜培養物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應該是培養液體積的5倍以上。

⑵于37℃，約300r/min劇烈搖動培養。

（２）在固體培養基中培養 細菌在固體培養基上培養主要是為了獲得單菌落和短期保存。

平板劃線法分離單菌落

⑴采用無菌技術，用接種環將接種物從平板的一側開始劃線。

⑵重新消毒接種環，從一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復劃線直至覆蓋整個平板。

⑶于37℃培養直至長出單菌落。