有絲分裂。稱作衛(wèi)星細(xì)胞的肌原細(xì)胞，相互融合在一起，形成多核的肌管細(xì)胞(myotubue cell)。隨著肌管細(xì)胞內(nèi)肌原纖維的數(shù)量增加，肌管細(xì)胞成為骨骼肌細(xì)胞。成熟的骨骼肌細(xì)胞是一種有絲分裂后細(xì)胞，不能進(jìn)行有絲分裂。
所以，雖然通過(guò)C6H15O12P3消化可進(jìn)行傳代3～4次，但如果發(fā)生分化，融合形成肌管，則很難再傳代下去。同樣，一旦細(xì)胞開(kāi)始融合，細(xì)胞增殖也很難評(píng)估。
以下所述為肌肉活檢組織酶消化法。來(lái)自健康人活檢的初代培養(yǎng)材料，富含肌原細(xì)胞，初代培養(yǎng)在Ham12補(bǔ)加20%胎牛血清培養(yǎng)條件下，很易生長(zhǎng)。
但原代骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)的難點(diǎn)就在于它的純化，因?yàn)槌杉〖?xì)胞和成纖維細(xì)胞混雜生長(zhǎng)很難區(qū)分。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞能夠增殖和分化融合形成多核細(xì)胞的肌管，證明培養(yǎng)的細(xì)胞有成肌性。
【材料】
1.組織來(lái)源健康人肌肉活檢組織。
2.培養(yǎng)用試劑
(1)培養(yǎng)液Ham F12。
(2)PBS。
(3)(Pronase)液：0.15%和0.03% EDTA，帶有20U/ml和20 ug/ml的(0.4% Eurobio PES3000)，溶在100ml Ham F12或PBS中。
3.培養(yǎng)基配方和制備Ham F12加20%胎牛血清。
4.實(shí)驗(yàn)器材100um過(guò)濾網(wǎng)、手術(shù)刀、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿(切割用)、培養(yǎng)瓶、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和離心管。
【方法】
1.取材用剪刀剪除活檢組織的非肌組織，用PBS抗生素緩沖液沖洗3次。按與肌肉纖維平行方向切割成小塊，在稱量之前用PBS沖洗3次。把組織小塊擺放在平皿上，切成lmm3大小的碎塊，不要擠壓造成傷害，用PBS沖洗3次，棄掉上清。
2.消化在37℃液中消化1小時(shí)(1～3mg組織需要15 ml消化液)，每3～5分鐘搖晃或吸管吹打使細(xì)胞分離。用吸管吹打消化物，使更多的細(xì)胞分散下來(lái)，培養(yǎng)液應(yīng)變得越來(lái)越渾濁。加入含20%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止消化，讓組織塊慢慢沉到管底。
3.分離細(xì)胞集合所得上清液，用100um過(guò)濾網(wǎng)濾過(guò)入20ml離心管中，進(jìn)行800r/min離心8～10分鐘，吸出上清液棄掉。加10ml生長(zhǎng)培養(yǎng)液重懸沉積物，用吸管輕輕吹打，然后用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞。
4.接種與培養(yǎng)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋?xiě)乙海臃N入培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度1.5x104個(gè)/ml。把培養(yǎng)瓶置入37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
【結(jié)果】
體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞，經(jīng)顯微鏡鑒定，剛分離出的原代細(xì)胞比較小，呈球形，折光性強(qiáng)。12小時(shí)后，細(xì)胞開(kāi)始貼壁，72小時(shí)后貼壁，貼壁后絕大多數(shù)逐漸延展成為梭形，少數(shù)有突起，為不規(guī)則狀，換液可在培養(yǎng)3天后進(jìn)行，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖、遷移并逐漸規(guī)律性地沿一個(gè)方向排列。
一旦細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶，產(chǎn)生接觸抑制，增殖將明顯受到抑制，表現(xiàn)為相鄰細(xì)胞相互融合，形成肌小管，即表現(xiàn)出分化傾向。
初始形成的肌小管的多個(gè)細(xì)胞核沿細(xì)胞中心排列，形成中心核鏈，而合成的少量肌原纖維則位于周邊。隨著分化的繼續(xù)，肌原纖維大量生成，逐漸占據(jù)細(xì)胞中的部位，迫使中心核鏈的核移向周邊，即形成幼稚肌纖維。另外還可以用組織塊法培養(yǎng)，約1周可見(jiàn)組織塊周?chē)兴笮蔚募?xì)胞爬出，但只是部分組織塊周?chē)屑?xì)胞。
透射電鏡下觀察，分裂增殖早期的骨骼肌細(xì)胞核含核仁1～3個(gè)，細(xì)胞質(zhì)中有不規(guī)則分布的束狀平行排列的肌絲，部分區(qū)域肌絲尚未形成，并有少量幼稚線粒體。
早期細(xì)胞內(nèi)有長(zhǎng)梭形高電子密度結(jié)構(gòu)，呈散在分布;晚期細(xì)胞胞質(zhì)肌絲更豐實(shí)，但無(wú)明顯肌節(jié)形成，可見(jiàn)分化較成熟的線粒體、糖原和游離核糖體聚集于肌束周邊，使豐實(shí)的肌絲呈束狀平行排列。
